Свердлов Е. Д.
Начинаем с интерферонов

Евгений Давидович Свердлов, лауреат Ленинской и Государственной премий, заведует лабораторией в Институте биоорганической химии им М. М. Шемякина АН СССР, а недавно избран директором Института молекулярной генетики АН СССР. Область его интересов - нуклеиновые кислоты. Он предложил оригинальную идею определения нуклеотидной последовательности - методом избирательной химической модификации.

Публикуемый рассказ Е. Д. Свердлова о генноинженерном интерфероне вводит читателя в это братство ученых, самых разных по положению, должности, специальности, умелости, предприимчивости. Братство, которое оказывается удивительно прочным, несмотря на возникающие конфликты - зачастую очень острые, прочным потому, что иначе просто невозможно делать всю эту науку.

Боюсь, что я вряд ли твердо знал, что такое интерфероны, когда наш директор, академик Юрий Анатольевич Овчинников, в середине 1980 года вызвал меня и сказал: "Женя, надо сделать интерферон человека генной инженерией. Это очень серьезная проблема". Я пытался слабо сопротивляться: "Мы не сможем... нет опыта... нет базы..." Ответом было: "Если у вас нет базы, то идите работать туда, где база есть". Я понял, что интерферон очень нужно сделать. Но как?

В общем виде я представлял себе, что надо делать. Прежде всего требуется получить ген, кодирующий интерферон. Для этого надо взять клетки человека, выделить из них информационные РНК (иРНК), получить с помощью фермента обратной транскриптазы комплементарные этим иРНК молекулы ДНК (кДНК); соединить кДНК с молекулами ДНК-векторов и ввести полученные рекомбинантные ДНК в бактериальные клетки. Далее те бактериальные клетки, в которые проникли рекомбинантные ДНК, можно поместить на твердую питательную среду. Клетки начнут размножаться, каждая дает потомство, и в том месте, куда она попала вначале, вырастет нечто очень напоминающее шляпку масленка. Одна шляпка состоит из миллионов совершенно одинаковых бактерий - потомков исходной пра-пра-пра... родительницы. Это потомство называют клоном, саму операцию такого размножения клеток - клонированном, а сумма всех клонов, в которую входят почти все кДНК, соответствующие множеству разных иРНК, синтезируемых клеткой, носит название библиотеки кДНК. В каждом клоне представлен только один тип кДНК. И вот в этой библиотеке нужно найти именно те клоны, где содержится запись об интерфероне. Их должно быть очень мало, так как среди множества информационных РНК вклетке на долю иРНК интерферонов приходятся, наверное, десятые, а то и сотые доли процента. Но как все это делать? У меня был вполне достаточный опыт экспериментальной работы, чтобы представлять пропасть между принципиальной простотой того, что я знал, и сложностью его практического исполнения. Каждая стадия - это полновесное "ноу-хау", а за "ноу-хау" не зря платят большие деньги.

Более того, все вышеизложенное лишь самое общее представление, которое годится на все случаи жизни, и, как всякая вещь, годящаяся на все случаи, для каждого конкретного случая подходит не самым лучшим образом.

Чтобы выбрать наиболее правильный путь получения библиотеки клопов и поиска в ней определенной кДНК, нужно хорошо представлять себе тот конкретный объект, который собираешься клонировать.

Знакомлюсь с проблемой

Разговор с директором состоялся в конце дня, и на завтра я отправился в библиотеку знакомиться с интерфероном поближе. Литература оказалась весьма обильной, и вот что я узнал.

В 1957 году А. Айзеке и Дж. Линденман показали, что клетки животных, инфицированных вирусом, выделяют в среду некий фактор. Этот фактор, будучи добавленным к здоровым клеткам, придает им устойчивость к действию вируса, то есть интерферирует (препятствует) его действию. Фактор назвали интерфероном. Ясно, что он мог бы стать универсальным противовирусным средством. Обычно клетки не синтезируют интерферон, синтез должен быть чем-то вызван (индуцирован). Один из способов подтолкнуть клетку - воздействие вируса. Далее. Интерфероны - это белки видоспецифичные, то есть если хочешь лечить интерфероном людей, то использовать для этого нужно интерферон человека. И еще. Существуют три группы интерферонов: a-интерферон, образующийся при действии вирусов на лейкоциты, b-интерферон, выделяемый клетками фибробластов, и g-интерферон (еще называемый иммунным), который способны синтезировать Т-лимфоциты. У человека a-интерферон состоит из смеси многих похожих белков, a b- и g-, по-видимому, представляют собой индивидуальные белки.

Интерферонов (любых) клетка выделяет очень мало. Например, из 1 л крови доноров можно получить около 0,000001 г лейкоцитарного интерферона. Иммунный интерферон значительно менее доступен, чем фибробластный или лейкоцитарный, и значительно менее изучен. Картина была безрадостная, из нее следовал вывод, что браться нам надо за лейкоцитарный интерферон, поскольку с иммунным дело совсем сложное, фибробласты мы культивировать не умеем, а вот лейкоциты, наверное, сможем получить.

Нужно было искать партнеров, которые умели бы эти лейкоциты индуцировать.

Несколько запомнившихся разговоров того времени:

- Говорят, ты собираешься получать генноинженерный интерферон?

- Да.

- Ну-ну...

- Слушай, я тут намереваюсь получать генноинженерный интерферон. Ты хочешь войти в команду?

- Старик, я не сумасшедший ...

Ищу партнеров

Я отправился в аптеку, где выяснил, что интерферон получают в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН СССР. Потом пошел в межведомственный совет по проблемам физикохимической биологии и биотехнологии к его ученому секретарю О. В. Старовскому, и вскорости было собрано совещание, в котором участвовали сотрудники института им. Гамалеи. Первый альянс был создан. Но в изначальном виде он оказался неплодотворным, примерно полгода было потрачено впустую. Затем на арене появился человек из того же института, который реально, а не на словах смог предоставить для работы достаточно лейкоцитов, индуцированных вирусом. Это был Владимир Павлович Кузнецов, из отдела, которым руководил академик АМН СССР В. Д. Соловьев. Валентин Дмитриевич Соловьев - пионер исследований интерферона в СССР, а В. П. Кузнецов руководит производством этого лекарства. И он настоящий энтузиаст. Дело сдвинулось с мертвой точки.

Оказалось также, что интерфероном интересуются во ВНИИ генетики Главмикробиопрома (директор В. Г. Дебабов), а в рижском Институте органического синтеза АН ЛатвССР мой хороший знакомый Э. Я. Грэн уже начал подобную нашей программу. Все мы договорились о кооперации.

Не успели начать работу, как одна за другой появились статьи группы Ч. Вейссманна из Швейцарии и группы Д. Гедделя из США, проведших клонирование и описавших структуры кДНК нескольких лейкоцитарных интерферонов, и статья Т. Танигучи из Японии, клонировавшего кДНК фибробластного интерферона. Было ясно, что проблемой активно интересуются во всем мире. Неудивительно: от интерферонов ждали многого. Некоторые исследования показывали их противоопухолевую активность, что само по себе подогревало интерес врачей, а широкий спектр противовирусной активности вообще не вызывал сомнений.

Выделяем иРНК интерферона

Позвонил В. П. Кузнецов: "Через три дня запускаем для вас лейкоциты. Как обрабатывать их после индукции?" После недолгого размышления мы решили забрать лейкоциты сразу после завершения индукции и выделять иРНК у себя, в Институте биоорганической химии.

Индукция закончилась поздно вечером. В 12 часов ночи лейкоциты были привезены из института им. Гамалеи к нам, и выделение иРНК началось...

К этому важному моменту мы готовились заранее - учились выделять информационные РНК из лейкоцитов свиньи. Тренировка оказалась полезной. Лейкоциты были разрушены, из них выделили все виды РНК, которые содержатся в клетке: рибосомные, транспортные, информационные. У иРНК есть отличительная особенность: она несет на конце "хвост" - полимер, составленный из одних аденозинов, полиА. За этот "хвост" ее можно вытянуть из смеси всех РНК.

Вытаскивающей "рукой" служат полимеры, ковалентно связаны с целлюлозой. Поскольку тимидин способен образовывать комплементарные пары с аденозином (вспомните знаменитые уотсон-криковские пары А-Т и Г-Ц), то олигоТ прочно связывается с "хвостом" молекулы иРНК и сорбируется на целлюлозе. Прочие РНК оказываются несвязанными.

Вот это все и проделали двое сотрудников нашей лаборатории - С. А. Царев и Т. В. Виноградова. За несколько циклов круглосуточной работы они выделили достаточно много иРНК. Но мы не знали, есть там что-нибудь относящееся к интерферону или нет. Проанализировать полученную иРНК помог К. Г. Газарян, заведовавший в то время кафедрой эмбриологии на биологическом факультете МГУ.

Там у них на биофаке есть большой аквариум, в котором живут любимые эмбриологами африканские шпорцевые лягушки - Xenopus laevis. Ооциты этих лягушек представляют собой клад для исследователей иРНК. Ооцит готов синтезировать белок с любой эукариотической иРНК - для этого он оснащен всем необходимым. Требуется только ввести РНК в цитоплазму ооцита. Делают это с помощью микроинъекций растворов, содержащих иРНК. Именно так и поступили сотрудники К. Г. Газаряна. Оказалось, что впрыскивание нашей иРНК придает экстрактам, полученным из ооцитов, интерфероновую активность - они подавляют размножение вирусов. Такой способностью не обладала иРНК, выделенная из неиндуцированных лейкоцитов. Вывод следовал однозначно - в нашей иРНК содержится та, что кодирует интерферон.

Первый опыт выделения иРНК оказался успешным. Потом это стало привычной операцией, но все мы хорошо помним волнение на каждом этапе отработки методики и радость каждой удачи. Потом у нас появились свои ксенопусы и впрыскивание в ооциты тоже было освоено. Но с каким же уважением смотрел я в первый раз на неказистых амфибий, казавшихся мне великолепными, и на людей, которые умели впрыснуть в миллиметровую бусинку ооцита несколько сотых микролитра раствора!

Двигаемся дальше

Следующим этапом должна стать обратная транскрипция: получить по нашим иРНК комплементарные им ДНК. Опять совершенно новая для нас операция. К счастью, среди моих приятелей не последнее место занимает такой человек, как Вадим Моисеевич Кавсан, работающий в Киеве, в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР. Среди множества совершенных им славных дел одно было замечено и отмечено Государственной премией СССР: он наладил в нашей стране производство обратной транскриптазы и готов был предоставить этот фермент для работы.

Но одной дружеской готовности мне было мало, и я предложил Кавсану проводить обратную транскрипцию вместе, чтобы сэкономить время и деньги, которые стоит этот фермент, не тратя то и другое на обучение работе с ним. Вадим тут же согласился и даже, вопреки обыкновению, не стал требовать взамен каких-нибудь дефицитных реактивов. Нет, не подумайте чего плохого - Вадим человек бескорыстный, но ведь он научный работник, хочет работать и сталкивается при этом в полной мере с недочетами системы снабжения научных исследований. Трудно предвидеть на долгий срок вперед, какие результаты даст эксперимент сегодня и, следовательно, какие вытекающие из этих результатов эксперименты придется делать завтра. Вести эксперимент - значит использовать реактивы, ферменты, посуду, оборудование. Мы заказываем это на год вперед, реально получаем года через полтора и, хотя стараемся предвидеть все на все случаи жизни, все равно ошибаемся. Если бы можно было часть средств использовать более гибко, давая заказы ну, скажем, за месяц! Экономило бы это деньги, и наука выигрывала бы. Если бы... Ну а пока...

- Вадим, у тебя есть обратная транскриптаза?

- Есть, но мне нужно 100 микрокюри меченых дезокситрифосфатов...

- Роберт, говорят у тебя есть концевая нуклеотидилтрансфераза?

- Ну есть, а вот нет ли у тебя немножко рестрик-тазы Xholl?

- Валерий Иванович, извините ради бога, но один доброжелатель утверждает, что у вас есть хороший кленовский фрагмент...

- Знаете, его очень мало, но если у вас есть экзо-нуклеаза-Ш, то можем поменяться...

Звонят телефоны, заключаются сделки, тратится время, хорошо, если у кого-нибудь есть...

А Кавсан человек действительно бескорыстный. Вскоре к нам на улицу Вавилова приехал его сотрудник Алеша Петренко, и они с Сергеем Царевым стали синтезировать кДНК. Проделали они примерно следующее. К смеси иРНК добавили олигоТ - такой же, какой был "пришит" к целлюлозе. В результате образовался комплекс, в котором олигоТ связан с "хвостом" в иРНК. Обратная транскриптаза присоединяет к олигоТ нуклеотиды, комплементарные иРНК и строит первую цепь ДНК. ОлигоТ играет роль затравки в этом синтезе. Без затравки обратная транскриптаза не работает - она должна с чего-то начать синтез. Вторую цепь ДНК синтезировали с помощью другого фермента, ДНК-полимеразы. Комплементарная ДНК была готова. Теперь ее нужно было клонировать.

Библиотека клонов,она же клонотека, она же банк кДНК

Некоторый опыт клонирования у нас уже был. Незадолго перед началом работы по интерферону мы сделали довольно симпатичную работу, в которой синтетическая ДНК, кодирующая маленький нейропептид - лейцинэнкефалин, была клонирована и встроена в геном Е. coli. Но то, что предстояло на этот раз, было, конечно, значительно сложнее.

В первом случае клонировали один определенный фрагмент ДНК и, в сущности, все полученные клоны содержали требуемую вставку. А теперь в смеси разных кДНК, которой мы располагали, присутствовала лишь ничтожная часть той кДНК, которая кодирует интерферон: 0,01% -одна десятитысячная часть смеси. Это означало: для того чтобы с вероятностью 99% обнаружить в библиотеке кДНК требуемый клон, нужно перебрать около 50000 клонов. Ну а если вдруг доля искомой РНК еще меньше? А закон Паркинсона?.. В общем, лучше бы получить клонов тысяч так двести, думал я.

И тут встало сразу несколько проблем. Первая - эффективность клонирования. Для работ с энкефалииом это было несущественно, а сейчас мы располагали примерно 2 мкг кДНК, из которых надо было получить 200 000 клонов, то есть на каждый нанограмм кДНК следовало получать хотя бы по 100 клонов.

Вообще-то, судя по научной литературе, ничего в этой задаче особенного не было - в других лабораториях получали и по 1000 клонов на нанограмм кДНК, по мы пока мало что умели и ориентировались на более скромные цифры.

Далее. Для клонирования лейцинэнкефалина все необходимые структурные элементы гена были запланированы при его синтезе. А теперь эти элементы еще нужно было присоединить к нашей кДНК. Перед нами были два пути. Один - так называемый полиГ - полиЦ тэйлинг (по-русски - присоединение "хвостов" или "охвостение"). Он состоит вот в чем. С помощью фермента концевой нуклеотидилтрансферазы к комплементарной ДНК пристраивают полиЦ - "хвосты". А плазмиду-вектор разрезают какой-либо рестриктазой и в местах разреза тоже наращивают "хвосты" - полиГ. Когда такие "охвостенные" плазмиды и кДНК смешивают, то полиЦ и поли Г взаимодействуют друг с другом и образуется рекомбинантная ДНК, которую можно клонировать.

Второй путь таков. С помощью фермента ДНК-лигазы к кДНК пришивают синтетические фрагменты, так называемые линкеры, в которых есть куски, узнаваемые определенной рестриктазой. Затем ДНК расщепляют этой рестриктазой и линкеры образуют так называемые "липкие" концы; выступающие одноцепочечные участки. Они всегда комплементарны тем концам, которые образуются при расщеплении любой ДНК именно этой рестриктазой. Затем ДНК-вектор разрезают данной рестриктазой; ДНК-вектор и кДНК смешивают, их "липкие" концы слипаются, и после сшивки ферментом образуются циклические рекомбинантные ДНК.

Было решено использовать оба пути. За метод тейлинга взялся С. А. Царев (звонок А. Бочарову из Института молекулярной биологии АН СССР: "Саша, ты не дашь нам немного нуклеотидилтрансферазы?"). А за линкерную методику - Галина Сергеевна Монастырская (звонок К. Г. Скрябину в тот же ИМБ: "Костя, дай пожалуйста, немного Hind III линкера!).

Что же касается микробиологической части работы, то есть введения рекомбинантных ДНК в клетки, высева их на твердую среду и получения клонотек, то за нее отвечала Елена Михайловна Ходкова (теперь она, во-первых, Зайцева, а во-вторых, к сожалению, уехала от нас в Ленинград). Многими трудами ей удалось достичь эффективности клонирования 100-200 (а время от времени и 300!) клонов на нанограмм ДНК. И вот две клонотеки получены.

Клоны были выращены на фильтрах из нитроцеллюлозы, которые лежали на питательном агаре, и с них были сняты копии (мы их называем репликами), то есть на каждый из фильтров клонотеки клали чистый фильтр, этот новый фильтр помещали на питательную среду, и в тех местах, где он соприкасался с клонами исходного фильтра, выросли новые клоны - от бактерий, перешедших с исходного фильтра. Реплики, таким образом, зеркально отображали распределение клонов в исходной клонотеке. На каждом исходном фильтре было около 2000 клонов, клонотека состояла из 200 фильтров (а ведь были еще копии), и во всем этом "стоге сена" нужно было найти "иголку" - клоны, содержащие кДНК интерферона.

Интерферон, ау!

Ю. А. Овчинников регулярно обсуждал со мной ход дела, советовал, энергично помогал организационно. Но его беспокоило, что двигаемся мы медленно. Получение интерферона входило в Государственную комплексную целевую программу "Биотехнология", и было невозможно не выполнить наши обязательства. Но ведь не все удается ускорить работами круглосуточными, без выходных и отпусков. Шла весна 1981 года, а у нас еще не было в руках гена. Более того, мы, честно говоря, не знали, как его искать. Испробовали несколько вариантов, которые ни к чему не привели. И некоторые сотрудники уже прямо спрашивали меня, а что будет, если не найдем? Об этом же думал и я.

Существовала еще одна возможность - использовать гибридизацию клонов с мечеными синтетическими олигонуклеотидными зондами. Опять совершенно новый для нас путь. Да еще и непростой, потому что химики, работавшие тогда с нами, синтезировали олигонуклеотиды и медленно и неохотно.

Одну из реплик кДНК на нитроцеллюлозных фильтрах обрабатывали щелочью, при этом колонии разрушались, ДНК в них денатурировала, то есть две ее комплементарные цепочки разделялись и сорбировались в той точке нитроцеллюлозного фильтра, в которой находился клон. Олигонуклеотиды синтезировали так, что они были комплементарны одной из цепочек кДНК интерферона и, следовательно, могли образовывать с этой цепочкой комплементарный комплекс. Если олигонуклеотид метить радиоактивным изотопом фосфора ³²Р, то при добавлении такого меченого олигонуклеотида к фильтру с сорбированной денатурированной ДНК он найдет комплементарную последовательность, свяжется с ней, и участок фильтра, где находился клон, содержащий эту последовательность, станет радиоактивным. Этот участок легко обнаружить с помощью радиоавтографии: рентгеновская пленка, приложенная к фильтру, засвечивается в участках, соприкасающихся с радиоактивными клонами.

Правда, бактерии на реплике при этом убиваются. Но можно на другой, параллельной реплике взять клон, положение которого совпадает с радиоактивной точкой на первой реплике, размножить этот клон, выделить плазмиду и определить ее структуру, чтобы убедиться, что это действительно кДНК интерферона.

Олигонуклеотиды были синтезированы, и работа по гибридизации началась. Ее делали С. Царев и я. Да только вот беда: все клоны давали некоторый фон радиоактивности из-за неспецифического связывания меченых олигонуклеотидов, и мы все время боялись пропустить нужные клоны, поскольку не знали, как отличается специфическая гибридизация от неспецифической. И вдруг на одном из фильтров какой-то клон дал сигнал значительно более интенсивный, чем другие. Ура!

Тотчас отыскали этот клон на параллельной реплике. Он действительно давал четкую гибридизацию с одним из олигонуклеотидов. Выделили из него кДНК, и Г. С. Монастырская определила ее первичную структуру. Ничего общего с геном интерферона!

Сильная гибридизация объяснялась случайным совпадением маленького участка структуры. Не виновата в этом была Галя, которая определяла первичную структуру, но злы мы были почему-то на нее. И все же клон этот сослужил нам полезную службу. Мы использовали его для контроля превышения сигнала над фоном и в дальнейшем на каждый фильтр клонотеки наносили в определенном месте бактерии из этого клона, чтобы сравнивать сигнал в этом участке с другими сигналами.

Вскоре многодневная тяжкая работа стала приносить плоды. В библиотеке из примерно 400000 клопов было найдено около двухсот клонов, дающих несомненный сигнал. А один из этих клонов давал гибридизацию с двумя разными олигонуклеотидами, комплементарными к разным участкам кДНК.

Если гибридизация с одним олигонуклеотидом еще могла быть случайной, то теперь ее случайность можно было считать очень маловероятной. И мы начали анализировать кДНК этого клона. А чтобы не терять времени, 50 гибридизующихся клонов отдали для параллельного анализа Дебабову и 50 отправили в Ригу.

В Риге к этому времени тоже завершали создание клонотеки, и мы переправили им меченые зонды для анализа и разработанные нами методики гибридизации... Оставшиеся 100 гибридизующихся клонов мы продолжали анализировать сами.

Пока шел этот анализ, Г. С. Монастырская определила первичную структуру фрагмента, гибридизовавшегося с двумя олигонуклеотидами. Он оказался полным геном одного из интерферонов, описанных Д. Гедделем,- интерфероном F, хотя и с некоторыми отклонениями, одно из которых мы приписали ошибке, сделанной Гедделем при определении первичной структуры. В остальном же - несомненный ген интерферона!

Напряжение многих месяцев спало. Я сообщил Ю, А. Овчинникову о находке, а на очередном совещании Междуведомственного совета сказал: "Поиск клонов и экспрессию генов можно сравнить с поиском и засолкой грибов соответственно. Если грибы найдены, то, плохо ли, хорошо ли, они будут засолены. Худо, когда грибов нет. А ген интерферона у нас уже есть".

Началась спокойная (сравнительно) полоса работы.

Вскоре из ВНИИгенетики сообщили, что в 50 переданных им клонах два содержат фрагменты другого гена интерферона - гена a₂, описанного незадолго до этого Ч. Вейссманном. (Эти фрагменты впоследствии были использованы коллегами из Главмикробиопрома как зонды для поиска генов в банке геномных генов, полученном ими от К. Г. Газаряна, и позволили легко обнаружить несколько геномных генов интерферона.) Мы же тем временем нашли фрагмент еще одного гена - a₁ (по номенклатуре Вейссманна)очень удобный тем, что его вырезала рестриктаза EcoRI - самая доступная из рестриктаз. Этот клон также был передан в Ригу и для контроля гибридизации, и как источник одного из фрагментов гена интерферона, который сам, будучи меченым, мог служить весьма специфичным зондом. Прошло некоторое время, и мы нашли в наших клонах еще несколько фрагментов гена интерферона a₂ и получили возможность вдобавок к гену F восстановить целый ген a₂, что вскорости и было сделано. Это было существенно, поскольку, по имевшимся тогда данным, именно интерферон a₂ был основным компонентом в природной смеси лейкоцитарных интерферонов. В дальнейшем один из концов этого гена мы заменили на фрагмент, найденный в Риге,- он давал большее удобство при операции вырезания гена из плазмиды.

Пока же шел этот поиск и анализировались фрагменты, мы начали следующую стадию работы - экспрессию генов интерферона. Иными словами, их надо было заставить работать в микробных клетках.

Экспрессировать - это не грибы солить

Е. coli (кишечная палочка) так долго была излюбленным объектом генетиков, что и в генную инженерию она вначале вошла как монополист. Однако у бактериальных клеток есть ряд недостатков. В частности они не способны правильно отщеплять сигнальные пептиды от белков млекопитающих, они не могут также осуществлять такие процессы, как процессинг и модификацию эукариотических белков. По этим причинам бактериальные клетки не всегда подходящие хозяева для чужеродных генов, хотя они и привлекательны простотой обращения. В последнее время стали разрабатывать системы экспрессии генов в бациллах, дрожжах, клетках растений и млекопитающих. Мы же начали с Е. coli.

Опять принципиально все было ясно. Во-первых, ген интерферона кодировал не тот интерферон, который выделяется из клеток при индукции вирусом, а интерферон-предшественник - более длинный белок, который в клетках млекопитающих расщепляется (говорят-"вызревает") и дает "тот", "зрелый", интерферон. Мы знали, что клетки бактерий не могут правильно расщеплять белки-предшественники млекопитающих и давать "зрелые" продукты. Следовательно, нужно исходный ген предварительно реконструировать - отделить часть, кодирующую только зрелый интерферон, от всего лишнего и присоединить к ней фрагмент ДНК, кодирующий два сигнала, необходимые, чтобы обеспечить синтез интерферона по иРНК,- один из них помогает иРНК связаться с рибосомой, а другой дает возможность начать синтез. Кроме того, к гену следует присоединить промотор - сигнальный элемент, обеспечивающий считывание гена, синтез иРНК,соответствующей гену интерферона.

Ни одна из этих операций не представляла для нас труда. В кратчайший срок первая конструкция была готова. Для ее изготовления к гену интерферона присоединили бактериальный промотор, который заставляет клеточные ферменты копировать этот ген в виде иРНК. Промотор мы позаимствовали у Е. coli - в бактерии он управляет синтезом ферментов, ведающих усвоением лактозы (так называемый lac-промотор). Вместе с промотором присоединили также сигналы начала синтеза белка. Эти сигналы считываются в составе иРНК и указывают клетке, где ей нужно начать синтез. Всю полученную конструкцию мы встроили в молекулу-вектор, способную размножаться в бактериальной клетке и передаваться из поколения в поколение.

Плазмиду со встроенным в нее геном интерферона ввели в клетку Е. coli. Клетки были выращены, разрушены, и по всем канонам в их экстракте должен был присутствовать интерферон. Экстракту надлежало обладать противовирусной активностью. Но он не обладал. Об этом сообщил нам В. П. Кузнецов, который анализировал активность. Взяли другой промотор, тоже заимствованный у Е. coli, но управляющий биосинтезом триптофана. Создали вторую конструкцию. Кузнецов проанализировал - есть интерферон! Но очень мало - 1л суспензии содержал около 10 мкг интерферона. Этот сигнал был подтвержден и сотрудником Института вирусологии А. С. Новохатским, который присоединился к нашей работе.

По нашим приближенным оценкам, потребность в интерфероне составляла несколько килограммов в год. Нетрудно посчитать, что при такой производительности для получения килограмма интерферона требовалось бы выращивать 10⁸ л бактериальной суспензии. И это - в лучшем случае, если бы интерферон при очистке не терялся. Наши коллеги из Главмикробиопрома (теперь Минмедбиопром) посчитали, что они смогут начать производство, если производительность штамма будет хотя бы 1 мг/л. Надо было в 100 раз увеличивать производительность. И началось...

К гену присоединяли разные промоторы, сильные, очень сильные, регулируемые, нерегулируемые. Чем сильнее промотор, тем больше молекул иРНК синтезируется в клетке, тем, казалось бы, больше интерферона должно вырабатываться. Однако ничего не менялось. Тогда началась другая эпопея - стали менять структуру элементов, регулирующих сам синтез белка. Эти усилия дали нам штаммы бактерий, продуцирующие до 0,2 мг интерферона. Уже кое-что, но надо было дотягивать до 1 мг.

Попробовали такой вариант: ген вместе с промотором вставили в особую плазмиду - так называемую "ран-эвэй" (убегающую). При низкой температуре в клетке содержится всего от двух до пяти таких плазмид. Но если повысить температуру до 40-42°С, то число их стремительно возрастает и достигает нескольких тысяч. Плазмиды убегают от клеточного контроля. Мы надеялись, что возрастет число копий гена в клетке и благодаря этому подскочит "количество" синтезируемого интерферона. Так и произошло: клетки, получившие убегающую плазмиду, после подогревания синтезировали до 5 мг/л. В лаборатории царило всеобщее ликование. Но оно гасло день ото дня: наши новые продуценты синтезировали все меньше и меньше интерферона, через месяц они опустились до 10 мкг/л и на этом уровне застыли.

"Психология" клеток, приводящая к этому эффекту, оставалась непонятной. Было ясно только одно: нужно искать дальше. Может быть, интерферон разрушается клеточными ферментами - протеазами? Взяли клетки с пониженным содержанием протеаз, перевели туда плазмиду - никакого эффекта. Возможно, иРНК интерферона разрушается клеточными рибонуклеазами? Перевели плазмиды в клетки с пониженным содержанием рибонуклеаз. Опять никакого эффекта. Попробовали... попробовали... и все безрезультатно. Ох, и поминали мои хорошие знакомые про засолку грибов!

Решение нашлось случайно и неожиданно. Внимательно изучив структуру промоторов, мы нашли способы реконструировать их для наших целей.

И получилось то, что надо! Простой, удобный в работе штамм, дающий желаемые несколько миллиграммов интерферона с литра. Штамм был, кроме того, удивительно стабилен. В дальнейшем описанная здесь конструкция "промотор-ген" была использована для экспрессии всех лейкоцитарных интерферонов - где бы ни были найдены их гены: у нас, в Риге и во ВНИИ генетики, везде она дала самые хорошие результаты.

В дальнейшем та же конструкция, будучи введенной уже не в Е. coli, а в другие бактерии, позволила достичь еще более эффективного синтеза. Это сделали уже наши коллеги из ВНИИ генетики и селекции. И в этом виде она пошла в промышленность.

Потом мы создали штаммы-продуценты рекомбинантного иммунного интерферона. У них на долю интерферона приходится 50% белка, синтезируемого клеткой. Потом была работа по изучению вируса гепатита А, направленная на создание вакцины. Потом мы вместе с лабораторией Ю. А. Овчинникова клонировали и изучили структуры огромных генов, кодирующих субъединицы важнейшего клеточного белка Na, К⁺-АТФазы. Потом мы наладили у себя получение обратной транскриптазы и концевой нуклеотидилтрансферазы и других ферментов и научились синтезировать олигонуклеотиды и многое другое. Но все это было потом, и в основе всего этого лежало то, что невозможно описать в статьях, что условно называют "ноу-хау" и что было приобретено в работе по клонированию и экспрессии лейкоцитарного интерферона.